A kutatás molekuláris biológiai módszerei és felhasználása

A kutatás molekuláris biológiai módszereinagy szerepet játszanak a modern orvostudományban, a kriminológia és a biológia területén. A DNS és az RNS vizsgálatok terén elért eredményeknek köszönhetően egy személy képes a szervezet genomjának tanulmányozására, a betegség kórokozójának azonosítására, a kívánt nukleinsav felismerésére savak keverékében stb.

Molekuláris biológiai vizsgálati módszerek. Mi ez?

Az 1970-es és 1980-as években, tudósokmegfejtik az emberi genomot. Ez az esemény lendületet adott a géntechnológia és a molekuláris biológia fejlődésének. Tanulmányozása tulajdonságait a DNS és RNS azt jelentette, hogy most már lehetséges, hogy ezeket a nukleinsavakat céljából betegség diagnózisa, tanulmány gént.

DNS és RNS előállítása

A diagnózis molekuláris biológiai módszereia kiindulási anyag jelenléte szükséges: gyakrabban nukleinsavak. Számos módon lehet ezeket az anyagokat elkülöníteni az élő szervezetek sejtjeitől. Mindegyiküknek előnyei és hátrányai vannak, és ezt figyelembe kell venni a nukleinsavak tiszta formában történő izolálási módjának kiválasztásakor.

1. DNS előállítása Marmur szerint. Az eljárás során az anyagok keverékét alkohollal kezeljük, aminek következtében a tiszta DNS kicsapódik. Ennek a módszernek a hátránya az agresszív anyagok használata: fenol és kloroform.

2. DNS-elkülönítés Boom által. Az itt alkalmazott alapanyag a guanidin-tiocianát (GuSCN). Elősegíti a dezoxiribonukleinsav lerakódását speciális szubsztrátokon, amelyekből később külön pufferrel gyűjthetők össze. Azonban GUSCN - inhibitora a TCP, és még egy kis része, hogy kerül elhelyezésre a DNS befolyásolhatja során a polimeráz láncreakció, ami fontos, ha dolgozik nukleinsavak.

3. A szennyeződések kicsapása. A módszer különbözik az előzőektől, mivel nem maguk a dezoxiribonukleinsav molekulák kicsapódnak, hanem szennyeződéseket. Ehhez használjon ioncserélőket. A hátrány az, hogy nem minden anyag csapódhat.

4. Tömeges szűrés. Ezt a módszert alkalmazzuk abban az esetben, amikor a DNS-molekula összetételére vonatkozó pontos információra nincs szükség, de statisztikai adatokat kell szerezni. Ez annak köszönhető, hogy a nukleinsav szerkezetét károsíthatja mosószerekkel való kezelés, különösen lúgokkal.

A kutatási módszerek osztályozása

A kutatás összes molekuláris biológiai módszere három nagy csoportra tagolódik:

1. Erősítés (különböző enzimek felhasználásával). Ez magában foglalja a PCR-polimeráz láncreakciót, amely számos diagnosztikai módszerben nagy szerepet játszik.

2. Nem nevezhető. Ez a módszercsoport közvetlenül kapcsolódik a nukleinsavak keverékének működéséhez. Példák a blotolás, in situ hibridizáció stb. 3 típusára.

3. Egy olyan szondamolekula jelének felismerésén alapuló módszerek, amelyek egy specifikus DNS- vagy RNS-próbához kötődnek. Egy példa egy Hibrid Capture System megoldás (hc2) hibridizációs rendszere.

Enzimek, amelyek molekuláris biológiai eljárásokban alkalmazhatók

A molekuláris diagnosztika számos módszere magában foglalja az enzimek széles körének alkalmazását. Az alábbiakban a leggyakrabban használt:

1. Restrictase - "vágja" a DNS-molekulát a szükséges részekbe.

2. DNS polimeráz - szintetizálja a dezoxiribonukleinsav kétszálú molekuláját.

3. Reverse transzkriptáz (revertáz) - az RNS mátrixon lévő DNS szintézisére használják.

4. DNS-ligáz - felelős nukleotidok közötti foszfodiészter kötések kialakulásáért.

5. Exonukleáz - eltávolítja a nukleotidokat a dezoxiribonukleinsav molekulájának végrészeitől.

A DNS-amplifikáció fő módja a PCR

Polimeráz láncreakció (PCR) aktíva modern molekuláris biológiában használják. Ez egy olyan módszer, amelyben nagyszámú másolat nyerhető egyetlen DNS molekulából (amplifikálják a molekulákat).

A PCR fő funkciói:

- betegségek diagnosztizálása;

a DNS és a gének klónozása.

Polimeráz láncreakció végrehajtásaa következő elemek szükségesek: kezdeti DNS-molekula, egy termostabil DNS-polimeráz (Taq vagy Pfu), dezoxiribonukleotid foszfátokat (nitrogénforrás bázisok), a primerek (Primer 2 1 DNS-molekula), és a puffer-rendszert is, amely lehet elvégezni az összes reakciók.

A PCR három szakaszból áll: denaturálás, láncindítás és nyúlás.

1. Denaturáció. 94-95 Celsius fokon a két DNS-szál közötti hidrogénkötések megtörése folytatódik, és ennek eredményeképpen két egyláncú molekulát kapunk.

2. A primerek hevítése. 50-60 Celsius fokos hőmérsékleten a komplementaritás típusával a primereket az egyszálú nukleinsavmolekulák végeire kötjük össze.

3. Nyúlás. 72 fokos hőmérsékleten a deoxiribonukleinsav leány kétszálú molekuláinak szintézise megy végbe.

DNS-szekvenálás

A kutatás molekuláris biológiai módszereigyakran szükségessé teszik a nukleotidok szekvenciájának ismeretét a deoxiribonukleinsav molekulájában. A szekvenálás a genetikai kód meghatározására szolgál. A jövő molekuláris diagnózisa a személy szekvenciájának meghatározásakor kapott ismereteken alapul.

A következő szekvenálási típusokat különböztetjük meg:

• Maxam-Gilbert által végzett szekvenálás;
• Sanger által végzett szekvenálás;
• piroszekvenálás;
• nanopórusos szekvenálás.